系统发育的建树方法都会预先假定一个进化模型（Penny et al., 1994）。比如，所有广泛使用的方法都假定进化的分歧是严格分枝的，因此人们可以用树状拓扑发生图来描述已知的数据。但是在一个给定的数据组中，因为存在着物种的杂交以及物种之间遗传物质的传递，这个假定很可能会被推翻。因此，如果所观察的序列并非是严格遗传的话，大多数系统发育方法就会得到错误的结果。
系统发育方法中固有的模型会导致一些额外的假定：
序列有指定的来源并且正确无误（Helbig and Seibold, 1996; Hershkovitz and Lewis, 1996; Soltis et al., 1997）。
序列是同源的（也就是说，所有的序列都起源于同一祖先序列）；这些序列不是“paralog“（paralog指的是一个祖先序列通过复制等方法在基因组中产生的歧化序列）的混合物。
序列比对中，不同序列的同一个位点都是同源的。
在接受分析的一个序列组中，序列之间的系统发育史是相同的（比如，序列组中不存在核序列与细胞器序列的混合）。
样本足以解决感兴趣的问题。
样本序列之间的差异代表了感兴趣的宽组。
样本序列之间的差异包含了足以解决感兴趣的问题的系统发育信号。
还有一些假定，在某些方法中是默认的，但是在另外一些方法中是可以修正的：
样本序列是随机进化的。
序列中的所有位点的进化都是随机的。
序列中的每一个位点的进化都是独立的。
提倡进行完全的计算机多重比对的人常常有这样的依据，他们认为手工比对通常都是含混不清的（Gatesy et al., 1993）。MALIGN（Wheeler and Gladstein, 1994）和TreeAlign（Hein, 1990, 1994）程序都试图在根据系统发育功能而优化比对的时候实现完全计算机化，尤其是试图通过初步的多重比对而优化出一个最大节约树（MP tree）。一般来说，只有当人们假定计算机程序能够进行正确的比对的时候，人们才会实行完全的计算机处理。之所以还提倡进行手工比对（比如，Thompson et al., 1994），是因为比对算法和程序还不能满足系统发育分析的需要。
许多计算机多重比对程序（比如CLUSTAL, PileUp,ALIGN in ProPack）根据明确的系统发育标准（一个前导树）进行比对，这个前导树是由双重比对得到的。但是SAM（Hughey et al., 1996）和MACAW（Lawrence et al., 1993）程序在进行多重比对时并不引入明确的系统发育标准，虽然这些程序也可以模拟系统发育过程操作参数。