天然染色体基本功能单位包括复制起始点(replication origin)、着丝粒(centromere)和端粒(telomere)。复制起始点,保证了染色体复制,着丝粒保证了染色体分离,端粒封闭了染色体末端,防止粘附到其他断裂端,保证了染色体的稳定存在[1] 。 人工染色体
人们为了克隆大片段DNA,利用DNA体外重组技术分离了天然染色体的基本功能元件并将它们连接起来,从而构成了人工染色体。相比于其他复制子而言,染色体要大得多[2] 。 染色体
酵母人工染色体(YAC)
酵母人工染色体(YAC)是人工染色体中能克隆最大DNA片段的载体,可以插入100-2000kb的外源DNA片段。YAC是有酵母的自主复制序列、着丝点、四膜虫的端粒以及酵母选择性标记组成的酵母线性克隆载体。左臂含有端粒、酵母筛选标记Trp1、自主复制序列ARS和着丝粒,右臂含有酵母筛选标记Ura3和端粒,然后在两臂之间插入大片段DNA构成的。
优点
可以容纳更长的DNA片段,用较少的克隆就可以包含特定的基因组全部序列,从而保持了基因组特定序列的完整性,有利于物理图谱的制作。
缺点
(1)克隆外源基因易出现嵌合体。
(2)有些克隆不稳定。
(3)YAC克隆不容易与酵母自身染色体相分离。
应用领域
在染色体区带构建YAC重叠群,可以促进大规模基因组测序和致病基因的克隆。
细菌人工染色体(BAC)
细菌人工染色体(BAC)是以细菌F因子为基础构建的细菌克隆载体。BAC克隆容量可以达300,可以通过电穿孔导入细菌细胞。 人工染色体
特点
拷贝数低,稳定,比YAC易分离。
P1派生人工染色体(PAC)
P1噬菌体载体是在P1噬菌体的基础上构建的克隆载体,用于克隆真核基因组DNA。
P1派生人工染色体(PAC)是将BAC和P1噬菌体载体二者优点结合起来的克隆体系,可以克隆100-300kb的外源DNA片段。
特点
(1)含有卡那霉素抗性基因,便于筛选
(2)由于其在宿主细胞中以单拷贝的形式存在,避免了因多拷贝造成的不稳定。
哺乳动物人工染色体(MAC)
哺乳动物人工染色体(MAC)指从哺乳动物细胞中分离出复制起始区、端粒以及着丝粒构建而成的克隆载体。它可以克隆大于1000kb的外源DNA片段。
应用领域
(1)有丝分裂和减数分裂对DNA片段大小的定量分析。