随着下一代测序或称为高通量测序 (High throughtput sequencing) 技术发展,可找出数以千万条 miRNA 之信息。 加上植 物 miRNA 通 常 与mRNA 进行完全或接近完全的配对引起标靶基因的剪切从而调控基因的表达,出现了一种新的实验方法称为降解组测序 (Degradome Sequencing),它结合了高通量测序技术与生物信息学分析各自的优势,已成功应用于拟南芥,水稻等植物的miRNA 标靶基因筛选。
降解组测序:Degradome sequencing,主要针对miRNA介导的剪切降解片段进行测序,从实验中筛选miRNA作用的靶基因,并结合生物信息学分析优势,确定降解片段与miRNA精确的配对信息。
靶基因经剪切产生二个片段,5’ 剪切片段和3’ 剪切片段。其中3’ 剪切片段,包含有自由的5’ 单磷酸和3’ polyA尾巴,可被RNA连接酶,连接产物可用于下游高通量测序;而含有5’ 帽子结构的完整基因,含有帽子结构的5’ 剪切片段或是其他缺少5’ 单磷酸基团的RNA是无法被RNA酶连接,因而无法进入下游的测序实验;对测序数据进行深入地比对分析,可以直观地发现在mRNA序列的某个位点会出现一个波峰,而该处正是候选的miRNA剪切位点(完整实验流程参见图1)。利用降解组测序,科研人员摆脱了生物信息学预测的限制,真正从实验中找到了miRNA的作用靶基因。 图1 实验流程
♦ 高通量:一次测序得到1000万条以上的序列
♦ 准确性高:从几个到数十万个拷贝的精确计数
♦ 高分辨率:可以检测单碱基差异
♦ 重复性好:深度测序保证了检测随机性,不需要技术重复
具体的生物信息分析如下:
1. 降解片段在选定的基因组上的分布
2. 鉴定样品中的rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、polyN等非编码RNA
3. 鉴定样品中表达的靶mRNA
4. 统计mRNA的降解位点信息
5. 从miRBase指定范围,寻找与降解的mRNA相关的miRNA,并作出示意图
降解组测序的应用,主要在确认上游 miRNA 的剪切基因,进而得知下游影响基因路径。可由miRNA 微数组芯片或利用下一代测序发掘新的miRNA,来获得 miRNA 表现量差异,从降解组测序确认 miRNA 剪切哪些基因,再由下游使用全基因芯片进一步检测影响基因表现量差异,结合生物信息 Gene Ontology (GO)、Pathway 分析与外表性状,将植物 miRNA 的调控,由上而下整体性了解分析,降解组测序适时的扮演在 miRNA 研究中对于确认剪切基因的关键性角色。