在自然界中,绝大多数的植物都是从土壤中生长出来的,它们从土壤中吸取营养和水分,同时也会被土壤中的各种细菌所侵染而致病。在众多的土壤细菌中,有两种农杆菌(Agrobacterium)一直是世界各国科学家们研究的热点,一种被称为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens),另一种被称为发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。它们都是革兰氏阴性菌,同属于根瘤菌科(Rhizobiacease)。这两种农杆菌之所以受到重视,主要就是因为它们都携带有一种特殊的质粒,这些质粒都可以被用于植物基因工程的遗传转化研究中[2] 。
农杆菌主要有两种:根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒上有一段T-DNA,农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入到植物基因组中。因此,农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系,被誉为“自然界最小的遗传工程师”[3] 。可以通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区,借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合,然后通过细胞和组织培养技术,得到转基因植物。
农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中,农杆菌的介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。此外,生物技术学家还可以通过发根农杆菌转化,在液体培养基中培养高密度的根,作为一种在转基因植物中获得大量蛋白质的方法。
农杆菌Ti质粒的T-DNA可高效率地整合到植物受体细胞的染色体上并得到表达。利用这一特点,Marton等(1979)以植物原生质体为受体首创了“共培养法”(co-cultivation)。后来经过一系列改进,特别是Horsch等(1985)建立的“叶盘共培养法”(leaf discco-cultivation),使这种转化方法更加实用。
所谓“共培养法”是指将根癌农杆菌与植物的原生质体、悬浮细胞、叶盘、茎段等放在一起共同培养而实现转化的方法。首先用打孔器从消毒的叶片上取得叶网片,亦称之叶盘,将其放在对数生长期的农杆菌的菌液中浸泡数秒钟后,置于培养基上共同培养2~3d。待叶盘周围的菌株生长至肉眼可见菌落时,转移到含有抑菌剂的培养基中除去农杆菌,同时在该培养基中加入抗生素进行转化体选择,经过3~4周的组织培养即可获得转化的再生植株。世界上已有的转基因植物,大多数是通过农杆菌介导法得到的[4] 。