道光十五年（1835）第二甲第四十九名进士出身，点翰林院庶吉士。道光十六年（1836），散馆授翰林院编修。道光二十二年（1842），历任司经局洗马、右赞善、左赞善、日讲起居注官，南书房行走。
道光二十三年（1843），升翰林院侍讲。道光二十四年（1844），升太仆寺少卿。道光二十五年（1845），升光禄寺卿，改太常寺卿。道光二十六年（1846），改任山东学政。道光二十七年（1847年），升内阁学士。道光二十八年（1848），迁兵部右侍郎。丁忧去职，服满后补任原官。
咸丰元年（1851），历任署理吏部右侍郎、兵部右侍郎、户部右侍郎，兼管钱法堂事务，南书房行走。
咸丰二年（1852），署理经筵讲官。八月六日授江苏学政。太平天国袭江南，何桂清以江苏学政身份疏陈军事，抨击封疆大吏软弱，无所顾忌侃侃而谈，咸丰帝感到惊奇。咸丰三年（1853），任礼部左侍郎。
咸丰四年（1854），任吏部右侍郎，改仓场侍郎，九月二十一日升浙江巡抚。太平军攻陷江宁（今江苏南京），东南震动。安徽徽州、宁国是浙江屏障，何桂清驻兵黄池，扼守要冲，与浙江提督邓绍良击退太平军。
咸丰五年（1855），令道员徐荣攻黟县、石埭，太平军主力到达后徽勇败，徐荣战死。何桂清上疏主张安徽浙江互为唇齿，主客一心方有胜算。咸丰帝上谕令地方官吏不分畛域剿敌。安徽巡抚移驻庐州，徽、宁二郡暂由何桂清管辖。何桂清令徽州知府石景芬、副将魁龄等收复徽州府城及休宁，布防堵敌军来路。江西太平军侵入浙江，攻陷开化，进犯遂安，檄令邓绍良等夹攻，击退之，周天受、石景芬等收复黟县、石埭。何桂清奏请增补道员缺额，准石景芬任徽宁池太道；总兵豫祺战绩不佳，革职，以江长贵代；前侍郎张芾驻皖南团练，督办徽、宁防务，兼顾浙江衢州、严州。
咸丰六年（1856），檄令邓绍良、秦如虎、都兴阿等合攻宁国府，江长贵击败来袭的太平军，收宁国府城。朝廷嘉奖。好友杭州知府王有龄被通判徐征讦控。何桂清复奏有微词，被中央责问，以病请辞，慰留。年底两江总督怡良解职，文渊阁大学士彭蕴章举荐何桂清可胜任江督统筹军饷。
咸丰七年（1857）春，以二品顶戴署理两江总督，随即实授。桂清举荐王有龄任江苏布政使，负责军饷。以江宁将军和春负责军事、江南提督张国梁为帮办、前总督怡良为运馈。桂清奏陈方略称旨，上谕和春商酌。冬，攻克镇江，以办理军饷功加太子少保。
咸丰八年（1858）11月，会同东阁大学士桂良、吏部尚书花沙纳与英、法、美三国改订税则、通商章程：1.有限承认鸦片贸易。2.依《中英五口通商章程》在上海创建关税总局。3.进出口货物，一律按时价抽5%关税，洋货远销内地一律按时价抽2.5%子口税。4.各口税收划一办理，聘请英人李泰国帮办海关税务等。