研究了甲基紫与核酸分子相互作用的紫外——可见光谱,在pH7左右,核酸包括小牛胸腺DNA,热变性DNA,酵母RNA能够与甲基紫相互作用,甲基紫最大吸收峰在579 nm,随着核酸的加入发生明显的减色效应,减色强度随着核酸浓度加大而增强,据此建立测定核酸的新方法,该方法线性范围宽、简便、快速。
2.1 主要仪器和试剂 λ-17紫外——可见分光光度计(美国Pekin-Elmer公司)。核酸溶液:小牛胸腺DNA,酵母RNA(中国科学院上海生物化学研究所)操作液浓度100 mg/L;甲基紫溶液:2×10-4 mol/L水溶液;Tris-HCl缓冲溶液:pH=7.4。试验用水均为二次蒸馏水。 减色效应
2.2 实验方法 在10 mL比色管中加入0.90 mL 2×10-4 mol/L甲基紫,适量核酸溶液和1.5 mL Tris-HCl缓冲溶液,并稀释至刻度,然后以试剂空白作参比,测定579 nm处的吸光度值。
3.1 紫外——可见光谱
甲基紫的最大吸收峰579 nm,随着核酸的加入产生减色效应,其减色强度与核酸浓度成正比,减色效应最大是小牛胸腺DNA,酵母RNA最小。
3.2 最佳酸度的选择
试验了不同介质条件下体系的减色效应影响,以1.5 mL pH 7.4 Tris-HCl缓冲溶液减色效应最强,且比较稳定。
3.3 甲基紫浓度的影响
固定核酸浓度,试验了不同浓度甲基紫对体系的影响,实验结果表明2×10-4 mol/L甲基紫0.9 mL时体系减色效应最大,且与核酸浓度具有良好的线性关系。
3.4 反应时间的影响
在室温条件下,体系的反应速度很快,5 min之内体系吸光度即可达到最大,并且在30 min之内基本保持稳定。
3.5 离子强度的影响
通过加入NaCl溶液来改变体系的离子强度,随着NaCl浓度的加大,可以抑制核酸对甲基紫的减色效应,在配制溶液或缓冲溶液的选择时应避免离子强度过大。
3.6 共存物质的干扰
按实验方法在一定量核酸存在下,大多数离子对核酸的测定影响不大,其测定结果的允许误差不超过±5%时,下列离子及有关物质不干扰测定(括号内的数字是核酸浓度的倍数),即Ca2+、Ba2+、Mg2+、Zn2+(>50),Mo(Ⅵ)、W(Ⅵ)、Fe3+、Ti(Ⅳ)、Cu2+、Co2+、Cd2+(30),Fe2+、As3+(30),乌嘌呤(5),胸腺嘧啶,嘌呤(3)对体系的测定无影响。唯有蛋白质对测定干扰较严重,测定前应预先除去蛋白质。
3.7 线性范围
实验了不同浓度DNA,热变性DNA,RNA线性范围及工作曲线,不同浓度的实验结果表明:对于小牛胸腺DNA,热变性DNA和酵母DNA的线性范围分别为0~5.0,0~5.0,0~10.0 mg/L。拟合的线性方程分别为A=-0.10C+0.984,A=-0.089C+0.979和A=-0.039C+0.978(A为吸光度,C为浓度)其相关系数分别为0.998,0.997和0.995。可见本方法的优点是线性范围宽,药品廉价易得,简便、快速,有一定实用性。