1385年末，海德堡大学初由大公鲁普莱希特一世（Ruprecht I）依教皇伍朋六世特许筹建，以为分裂的普法尔茨营造一思想中心，第一任校长是英格恩的马西利乌斯（Marsilius of Inghen），他是海德堡大学的创始人之一，他担任了不下9次校长。在1386-1392年和1396年期间吸纳外邦人才，服务于教会及国家。而早期的教授均来自宗教分裂与民族战争频仍地区，寻求平和于海德堡。14世纪彼得教堂成为大学教堂。历任大公均对大学倾注心力，然当其虑及必要时，亦得随意插手大学自主自治之事务。由此也为诸如人文主义等思潮的到来创造了历史条件。
宗教改革
尽管马丁·路德于1518年倡导宗教改革，海德堡大学长时间均未受此影响。直到1556年时才由奥腾里希（Ottheinrich）大公将其转变为一个新教大学。16世纪后半叶由弗里德里希三世（Friedrich III）将海德堡大学建成了具有加尔文主义精神的欧洲科学与文化中心。其加尔文主义理念的光芒吸引了全欧众多教授与学者纷涌而至。在神学院的影响下，1563年出现了著名的海德堡教理问答录。除加尔文主义外，16世纪末出现了后人文主义。
三十年战争
这一黄金时期延续至1618年。三十年战争使海德堡大学受到重创，教学几经中断。1622年举世闻名的帕勒提那图书馆移往罗马。战后大学重建工作又因1693年路易十四（Ludwigs XIV. 法语 Louis XIV.）的军队对海德堡的全面毁坏而陷于停滞。海德堡大学因此又关闭多年。
十八世纪
18世纪的海德堡正如几乎所有其它大学那样弥漫着知识上的中庸主义。一直延续的新教主义色彩因迟来的改革而逐渐丧失。财政上的困境与18世纪末不断的革命战争使海德堡大学再次陷入困境。
十九世纪
1802年海德堡划入巴登州，翻开了大学历史新的一页。海德堡大学重新组织后，成为国家财政支撑的教研机构。巴登州第一位大公卡尔·弗里德里希的名字被写入大学基金会的名单，从此，大学的全称成了“鲁普莱希特-卡尔斯-海德堡大学”。大学受到新人文主义的影响，同时许多教授和学者也是浪漫主义思潮的追随者。哲学家黑格尔曾于海德堡执教两年；施罗塞尔建立了政治史科学的海德堡学派；医学家马克西米利安·约瑟夫·冯·切利乌斯更令全欧的患者慕名而至。海德堡的教授们屹立于自由主义的最前沿，许多人还是1848年法兰克福国民大会的议员。1848革命后，路德维希·霍伊塞尔（Ludwig Häusser）成为自由民族国家主义在德国西南部的代言人。海德堡大学的自然科学在罗伯特·本森，古斯塔夫·基希霍夫及赫曼·冯·赫姆霍茨等人的共同努力下闪耀着眩目光辉的19世纪，同时也是海德堡以法学闻名于世的时代。1886年海德堡大学度过了500年校庆。