双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其频率可以达到 80 至 100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。
双光子荧光显微镜有很多优点：
1.长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；
2.焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；
3.长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；
4.使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。
多光子成像
多光子成像
电生理数据记录
配备固定载物台的双光子显微镜能提供最佳的机械稳定性，将电噪声干扰减至最低，可以说是专为活体标本及电生理而设。而可远程操控的2孔切换物镜转盘能实现无振动切换避免给复杂高稳定要求的实验带来干扰。物镜带防腐蚀陶瓷表面，以及延展至红外范围的色差校正，是同时进行多光子成像以及电生理数据记录的理想工具。
一些配备前置补偿的飞秒级激光器和OPO激光器的双光子显微镜，所有红外激光器的操控，包括前置补偿单元的微调等，都能由徕卡软件完成。有了OPO激光器之后，红色和绿色荧光都能同时被激发了，从而达到更好更清晰的记录效果。 双光子显微镜
空间站在轨应用
2023年2月，神舟十五号航天员乘组使用由中国自主研制的空间站双光子显微镜开展在轨验证实验任务并取得成功。这是目前已知的世界首次在航天飞行过程中使用双光子显微镜获取航天员皮肤表皮及真皮浅层的三维图像，为未来开展航天员在轨健康监测研究提供了全新工具。[1]