饲养层的影响，主要体现在饲养层种类、丝裂霉素处理饲养层的时间、饲养层细胞的代数和饲养层细胞的密度等。动物种类不同对饲养层种类的要求也不同。
STO PMEF： 对各种动物都较适宜，，但最可靠的方法还是根据动物种类筛选最佳饲养层为宜。有研究表明，PMEF比STO更适合用于小鼠ES（胚胎干细胞）的培养。 大鼠胚胎干细胞在饲养层细胞上培养
UE（子宫上皮细胞）
BRL（大鼠肝细胞）等
动物种类
需要经过筛选来确定最适宜该种动物ES分离克隆的饲养层
丝裂霉素处理滋养层的时间
丝裂霉素（常用有丝分裂阻断剂）处理时间在小鼠成纤维细胞上一般要求为：在37摄氏度，5%二氧化碳饱和温度的条件下处理24h，时间过短达不到预定目的，成纤维细胞不能被成功地抑制住，时间过长则使细胞老化，活性下降，分泌因子的能力降低，从而直接影响ES细胞增殖和分化的抑制。同时处理完的清洗工作也很重要，一般要求用无钙镁PBS冲洗4~5遍，以确保丝裂霉素的彻底清除。
饲养层细胞的代数及密度
以小鼠成纤维细胞为例，选3~5代，密度为10^6-10^7个/ml为宜，代数过低所含杂细胞太多，代数过高则细胞活力降低。